2. Diluer le tampon de lavage au taux de dilution 1:40 avec de l'eau distillée avant utilisation.
3. Ajoutez 100 μL de diluant d'échantillon dans le puits correspondant (ne pas ajouter dans le puits à blanc, négatif
puits de contrôle et puits de contrôle positif.) L'échantillon doit correspondre au nombre de micro
plaque, chaque plaque doit être fournie avec un contrôle négatif 2 puits, un contrôle positif 1 puits et un blanc
contrôler 1 puits. Ajouter 5μL d'échantillon dans le puits correspondant, bien mélanger à l'aide de la pipette, ajouter
50 μL de contrôle négatif et de contrôle positif dans les puits de contrôle négatif et le puits de contrôle positif (ne pas
ajouter le puits vide).
Remarque : utilisez un embout de pipette jetable séparé pour chaque échantillon, contrôle négatif et positif afin de
éviter la contamination croisée.
4. Secouez doucement pour mélanger pendant 30 secondes. Incuber à 37°C pendant 20 minutes avec la membrane de la plaque d'étanchéité
sceller la plaque.
5. À la fin de l'incubation, retirez et jetez le couvercle de la plaque. Sortez, ajoutez du tampon de lavage à
chaque puits pendant 20 secondes. Répétez 5 fois. Après le dernier cycle de lavage, retournez la plaque sur
papier buvard ou une serviette propre et tapotez-le pour éliminer les restes.
6. Ajouter respectivement 50 µL de conjugué enzymatique (ne pas ajouter dans le puits à blanc)
7. Incuber à 37°C pendant 20 minutes avec la membrane de la plaque de scellement scellant la plaque. Répétez le
laver l'étape 5 fois comme à l'étape 5.
8. Ajoutez 50 µL de substrat A et 50 µL de substrat B (ne pas ajouter dans le puits à blanc). Incuber à 37 ℃ pendant
10 minutes avec la membrane de la plaque de scellage scellant la plaque.
9. Ajoutez 50 μL de solution d'arrêt dans chaque puits (ne pas ajouter dans le puits à blanc). Mélangez délicatement en secouant, lisez le
absorbance dans les 10 minutes après l’arrêt de la réaction. Calibrez le lecteur de plaque avec le Blank
bien et lisez l'absorbance à 450 nm. Si un instrument à double filtre est utilisé, définissez la référence
longueur d'onde à 630 nm. Aucun puits à blanc n'est autorisé si vous utilisez une double longueur d'onde pour détecter. Calculer le
Valeur seuil et évaluer les résultats.
Chronométrie : Lisez la densité optique (OD) de l'échantillon à 450 nm avec un lecteur de microplaques.
La valeur moyenne du contrôle négatif OD ≤ 0,1 et la valeur moyenne du contrôle positif OD ≥ 0,8, le test est valide,
sinon le test n'est pas valide.
Valeur seuil (CO) = valeur moyenne de DO du contrôle négatif x 3 (calculée par 0,10 lorsque la valeur moyenne
La valeur OD du contrôle négatif est <0,10, calculée par la valeur réelle lorsque la DO moyenne du contrôle négatif
la valeur est > 0,10)
Résultats positifs : valeur de DO de l'échantillon ≥ CO
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